Technische Universiteit Delft
Alle promoties, intree- en afscheidsredes worden gehouden in de Aula van de
TU Delft, Mekelweg 5, Delft
Promotie
Biokatalyse
5 juni 2002 | 10.30 uur
hr. A.V. Cherepanov | Novosibirsk State U. Rusland
promotoren | Prof.dr. S. de Vries en prof.dr. W.R. Hagen (fac TNW)
TY DNA ligase: mechanism of catalysis, substrate specificity and application
to a novel method of scanning mutagenesis
In dit proefschrift worden de substraatspecificiteit en het mechanisme van
katalyse onderzocht van de ATP afhankelijke DNA ligase van de bacteriofaag
T4. Eén van de conclusies luidt dat de specifieke details van de katalyse
levende organismen een bescherming bieden tegen de ophoping van ongewenste
mutaties. Tevens zijn de resultaten direct toegepast in een nieuwe
mutagenese strategie. Hiermee is het mogelijk om in één enkele stap een
bibliotheek te vervaardigen waarin alle mogelijke enkelvoudige
aminozuurmutaties van een eiwit zijn vertegenwoordigd.
Wat de fundamentele enzymologie van DNA ligases betreft, zijn de volgende
onderwerpen diepgaand bestudeerd: a) het mechanisme waarmee een
enkelstrengsbreuk in dsDNA wordt herkend en waarvoor wordt voorgesteld dat
een B-naar-A DNA helix conformatieverandering een belangrijke rol speelt; b)
het mechanisme van de nucleotidyl-overdracht via een twee-magnesium ion
mechanisme met een pentagecoördineerd fosforaan-atoom als intermediair; c)
een vergelijking van de structuur van DNA en RNA ligase met die van andere
nucleotidyltransferasen waaruit het bestaan van een gemeenschappelijke
eiwitvouwingsstructuur aannemelijk wordt gemaakt die direct verantwoordelijk
is voor katalyse en d) de substraatspecificiteit in het bijzonder die van
niet-complementaire nucleotiden.
T4 DNA ligase wordt toegepast in een nieuw 'saturation scanning mutagenesis'
(SSM) protocol als het sleutelenzym dat trinucleotide mismatches aanbrengt
in dsDNA. Het SSM protocol zoals in dit proefschrift is ontwikkeld bestaat
uit drie belangrijke stappen: 1) Bereiding van een verzameling megaprimers
volgens het nieuwe principe van "reversibele ketenverlenging". Hierin wordt
dsDNA gesequenced met ddNTP's waarna de 3'-ddNMP's worden verwijderd met
Exonuclease III. 2) Ligatie van mutagene oligonucleotiden aan de megaprimers
door T4 DNA ligase. De gebruikte mutagene oligonucleotiden bevatten een
trinucleotide mismatch, een 6-meer, 4096-voudig, ontaarde bindingsplaats en
fosfaatgroepen aan zowel de 3'- en de 5'-uiteinden. 3) Verlenging van de
ligatieproducten door DNA polymerase hetgeen resulteert in een kloonbank die
bestaat uit het oorspronkelijke wilde type en alle mogelijke enkelvoudige
aminozuurmutaties.
Voor verder lezen:
* Molecular and cellular mechanisms of mutagenesis, symposium,
Gatlinburg, Apr. 1981
* Site-directed mutagenesis and protein engineering, 1991
* DNA replication and mutagenesis, by Moses, Robb E., 1988
Maarten van der Sanden
Wetenschapsvoorlichter
Communicatie & Marketing Groep / TU Delft
tel.: 015 2785454
fax.: 015 2781855
GSM: 06 20408176